产品货号：
YTB3092
中文名称：
ChIP检测试剂盒(蛋白A/G磁珠)
英文名称：
BalbChIP Chromatin Immunoprecipitation Assay Kit with Protein A/G Magnetic Beads
产品规格：
22T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品用于通过免疫沉淀来沉淀和目标蛋白结合的染色质片段，最后通过PCR或Southern等方法来检测沉淀的染色质片段的试剂盒。通常用于检测特定的转录因子或组蛋白等基因组DNA结合蛋白是否和预期的特定基因组DNA序列在同一复合物中。
本试剂盒采用了Protein A/G磁珠，适合于免疫沉淀更多种类的抗体，包括mouse IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgA,rat IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG2c,rabbit IgG,rabbit and goat polyclonal Abs，以及human IgG1,IgG2,IgG3和IgG4。磁珠法比琼脂糖法更方便、快捷。常规的琼脂糖法需要长时间离心，而磁珠法无需离心，只需要短时间磁性分离即可，可以有效避免因为离心对免疫复合物造成的机械力影响，充分保证免疫复合物的天然状态。
本试剂盒中经过鲑鱼精DNA预饱和的Protein A/G琼脂糖和目的基因组DNA的非特异性结合大大下降。如果ChIP产物用于染色质免疫共沉淀测序(ChIP-Seq)，需要从数据中去除可能的鲑鱼精DNA数据。
| 组分 | 规格 |
| Protein A/G磁珠/鲑鱼精DNA | 3mL |
| 10×Glycine Solution | 30mL |
| ChIP Dilution Buffer | 48mL |
| Low Salt Wash Buffer | 24mL |
| High Salt Wash Buffer | 24mL |
| LiCl Wash Buffer | 24mL |
| TE Buffer | 48mL |
| 0.5M EDTA | 250μL |
| 5M NaCl | 500μL |
| 1M Tris,pH6.5 | 500μL |
| SDS Lysis Buffer | 10mL |
| Control Primers (5μM each) | 100μL |
保存：2～8℃，有效期1年。
提供了预混合的Control Primers，可用于扩增human GAPDH的部分相应序列，引物序列为：
5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3'；
5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3'。
- 需自备用于ChIP的一抗，37%甲醛，PBS溶液，蛋白酶抑制剂混合物(哺乳动物样品专用)、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(哺乳动物样品专用)或PMSF，Elution Buffer (1% SDS,0.1M NaHCO3)，蛋白酶K溶液(20mg/mL)，Glycogen(无核酸酶/蛋白酶)或Glycogen(20mg/mL)，Tris平衡苯酚，氯仿，95%乙醇，70%乙醇，3M NaAc(pH5.2)以及细胞刮或细胞铲，磁力架。
- 需自备样品超声处理仪，也称超声粉碎机或超声细胞粉碎机。
- 使用甲醛时请在通风橱中进行操作。
- 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
- 样品超声处理条件的优化：
- 准备适量冰浴预冷的PBS，以及适量的蛋白酶抑制剂或蛋白酶磷酸酶抑制剂。将SDS Lysis Buffer适当温浴，使其中的SDS充分溶解，并混匀。
- 推荐使用蛋白酶抑制剂混合物(哺乳动物样品专用)、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(哺乳动物样品专用)或PMSF。如果涉及蛋白磷酸化，宜添加蛋白酶磷酸酶抑制剂。如果涉及蛋白的乙酰化或甲基化，比较理想的情况，还需要添加相应的蛋白去乙酰化酶和蛋白去甲基化酶抑制剂。PMSF的最终浓度通常以1mM为宜，须注意PMSF水性溶液一定要新鲜配制，其在水相中的半衰期约为30分钟。
- 将细胞培养于10cm细胞培养皿中，细胞培养液的用量为10mL。在预期发生目的蛋白和基因组DNA结合的时间点，直接在细胞培养液中加入适量甲醛，轻轻混匀，至最终浓度为1%。随即在37℃孵育10分钟，以交联目的蛋白和相应的基因组DNA。例如，对于常规的每个10cm细胞培养皿中加入10mL细胞培养液的情况，需加入270μL 37%甲醛。请注意尽量使用高质量的在有效使用期限内的甲醛。细胞也可以培养于6cm细胞培养皿中，相关溶液的用量需按照比例进行相应调整。
- 加入1.1mL 10×Glycine Solution，轻轻混匀。室温放置5分钟。
- 将有细胞样品的培养皿置于冰浴上。吸尽含甲醛和glycine的培养液，尽量保持没有液体残留。
- 在上述室温放置5分钟期间，冰浴预冷的PBS中加入适量的蛋白酶抑制剂或蛋白酶磷酸酶抑制剂。
- 加入5～10mL冰浴预冷的含蛋白酶抑制剂的PBS，洗涤细胞，吸尽液体，尽量保持没有液体残留。
- 再加入5～10mL含冰浴预冷的含蛋白酶抑制剂的PBS，进一步洗涤细胞，吸尽液体，尽量保持没有液体残留。
- 加入1mL冰浴预冷的含蛋白酶抑制剂的PBS，用细胞刮或细胞铲刮铲下细胞，收集至离心管中。如果细胞可以用移液器吹打下来，也可以用移液器吹打。对细胞进行计数，分装成每管大约100万细胞。
- 4℃，800～1000g×g离心1～2分钟，以充分沉淀细胞。如果发现沉淀不充分，可以适当延长离心时间。吸尽上清，尽量减少液体残留。
- 配制适量含蛋白酶抑制剂的SDS Lysis Buffer。上一步骤的100万细胞沉淀用0.2mL含蛋白酶抑制剂的SDS Lysis Buffer重悬。
- 在冰浴上孵育10分钟，以充分裂解细胞。
- 超声处理，以剪切基因组DNA，使DNA大部分断裂成200～1000bp大小，如果能把大部分控制在400～800bp则更佳。超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中，并且处于较低温度。超声剪切的效果在后续去交联后可以用常规的DNA琼脂糖凝胶电泳检测。超声处理的条件通常可以设置为10秒每次，共3～4次，功率为50W时设置为最大功率的30%，采用2mm超声头。不同的超声处理仪器的设置不太一样，摸索超声条件时，可以先固定其他条件，先确定每次超声多长时间不会导致明显发热，然后摸索不同的超声次数。直至找到比较合适的超声次数可以使大部分基因组DNA断裂成200～1000bp大小。需要注意的是每次的超声体积和细胞用量宜固定，否则就不能使用一个相对比较固定的超声条件用于后续实验。
- 在0.2mL经过超声处理的样品中加入8μL 5M NaCl，混匀。65℃加热4小时，以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。
- 加入等体积的Tris平衡苯酚，vortex剧烈混匀，随后4℃，12000×g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。
- 加入等体积氯仿，vortex剧烈混匀，随后4℃，12000×g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。
- 上述步骤1.n和1.o的酚氯仿抽提可以使用DNA纯化试剂盒进行操作。例如产物DNA纯化试剂盒。
- 取少量通过酚氯仿抽提或DNA纯化试剂盒获得的液体，对于酚氯仿抽提产物可以取5～10μL，对于DNA纯化试剂盒纯化产物可以取2～5μL，进行琼脂糖凝胶电泳，观察超声处理对于基因组DNA的剪切效果。
- 准备适量冰浴预冷的PBS，以及适量的蛋白酶抑制剂或蛋白酶磷酸酶抑制剂。将SDS Lysis Buffer适当温浴，使其中的SDS充分溶解，并混匀。
- 染色质免疫沉淀：
- 在对样品超声处理条件进行优化后，对于待检测样品按照步骤1.a～k进行操作，并参考步骤1.l进行超声处理。
- 随后对于经过超声处理的样品在4℃，12000～14000×g离心5分钟。取上清(约0.2mL)至一2mL离心管中，置于冰浴。
- 配制适量含蛋白酶抑制剂的ChIP Dilution Buffer。加入1.8mL含蛋白酶抑制剂的ChIP Dilution Buffer以稀释经过超声处理的样品，使最终体积为2mL。
- 取出20μL (1%)样品作为Input用于后续检测。其余近2mL样品加入50μL Protein A/G磁珠/鲑鱼精DNA，在4℃缓慢转动或摆动混匀30分钟。此步骤的目的是减少Protein A/G磁珠/鲑鱼精DNA和目的蛋白或目的DNA序列的非特异性结合。然后置于磁力架上分离10秒，将上清转移至一个新的2mLmL离心管中。
- 去除非特异性结合为选做。
- 样品中加入适量一抗，一抗的用量可以参考抗体的说明书。如果抗体的说明中未给出用于ChIP的稀释比例，可以参考普通的免疫沉淀的稀释比例。通常一抗的用量为0.5～1μg。4℃缓慢转动或摆动混匀过夜或至少4小时以上。
- 可以不加抗体作为阴性对照，或更理想地使用正常的IgG (Normal IgG)作为阴性对照，同时可以用没有细胞样品的溶液作为空白对照，加入适量ChIP级别的抗体作为阳性对照。
- 加入80μL Protein A/G磁珠/鲑鱼精DNA，4℃缓慢转动或摆动混匀60分钟，以沉淀一抗识别的蛋白或相应的复合物。
- 置于磁力架上分离10秒，去除上清，切勿触及磁珠。依次使用如下溶液对磁珠进行洗涤，每次洗涤液的用量为1mL，每次4℃缓慢转动或摆动洗涤3～5分钟，随后置于磁力架上分离10秒，小心去除上清，切勿触及磁珠。
① Low Salt Wash Buffer洗涤一次。
② High Salt Wash Buffer洗涤一次。
③ LiCl Wash Buffer洗涤一次。
④ TE Buffer洗涤两次。
说明：完成上述所有洗涤步骤后所获得的沉淀即可用于PCR扩增目的基因序列或用Southern检测目的基因序列，或者用于Western检测等。
- 在对样品超声处理条件进行优化后，对于待检测样品按照步骤1.a～k进行操作，并参考步骤1.l进行超声处理。
- PCR扩增目的基因序列(如果ChIP产物用于检测目的基因序列)：
- 新鲜配制适量Elution buffer (1% SDS,0.1M NaHCO3)。
- 完成步骤2.g后，即完成所有洗涤步骤后，加入250μL Elution buffer。Vortex混匀，室温转动或摆动继续洗脱3～5分钟。
- 置于磁力架上分离10秒，将上清转移到一新的离心管中。沉淀中再加入250μL Elution buffer。Vortex混匀，室温转动或摆动继续洗脱3～5分钟。
- 置于磁力架上分离10秒，取出上清。和上一步骤，即步骤3.c中获得的上清合并。共计约500μL上清。
- 在500μL上清中加入20μL 5M NaCl，混匀。65℃加热4小时，以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。对于步骤2.d获得的作为Input的20μL样品，加入1μL 5M NaCl，混匀，65℃加热4小时，同样用于去除蛋白和基因组DNA之间的交联。此步骤完成后可以继续进行后续步骤，也可以先-20℃冻存，第二天继续后续步骤。
- 此时的样品已经可以用于PCR，可以尝试使用1、2、5或10μL样品作为模板用于PCR检测目的基因。此时PCR的扩增效果和可能被沉淀下来的DNA的量、以及整个PCR扩增体系是否容易扩增目的基因有关。如果发现PCR扩增效果欠佳，可以考虑通过后续的纯化步骤，纯化并浓缩样品，或优化PCR扩增用引物，然后再进行PCR检测。
- 通常情况下，推荐进行后续纯化后再进行PCR检测，而Input通常不必进行后续纯化步骤。
- 在约520μL样品中加入10μL 0.5M EDTA，20μL 1M Tris,pH6.5和2μL 20mg/mL蛋白酶K。混匀后45℃孵育60分钟。
- 加入等体积Tris平衡苯酚，vortex剧烈混匀，随后4℃，12000×g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。
- 加入等体积氯仿，Vortex剧烈混匀，随后4℃，12000×g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。
- 加入20μg Glycogen，加入1/10体积的3M NaAc,pH5.2，再加入2.5倍体积无水乙醇。混匀后-70℃沉淀不少于1小时，或-20℃沉淀8小时以上。
- 4℃，12000～14000×g离心10分钟，小心吸去大部分上清，切勿触及沉淀。
- 加入约1mL 70%乙醇洗涤沉淀。4℃，12000～14000×g离心10分钟，小心吸去大部分上清，切勿接触沉淀。
- 4℃，12000～14000×g离心1分钟，非常小心地吸除残留液体。
- 用少量TE或水重悬DNA沉淀，用于目的基因的PCR检测。用于PCR的引物最好能设计2组，可以用Input作为模板预先摸索出相应的PCR条件，并选择一组效果较好的引物用于最终的PCR检测。少数情况下，当PCR条带过弱时，可以采用巢式PCR (Nested PCR)技术，进行两轮扩增。在用常规PCR扩增出目的条带后，后续可以直接使用样品进行qPCR定量检测，也可以使用该样品进行建库和高通量测序(ChIP-seq)。
- 步骤3.g～m也可以采用适当的DNA纯化试剂盒纯化DNA，如PCR产物DNA纯化试剂盒或磁珠法PCR产物DNA纯化试剂盒。
- 新鲜配制适量Elution buffer (1% SDS,0.1M NaHCO3)。
- Western检测ChIP产物(如果ChIP产物用于Western检测)：
- 接步骤2.g，在完成所有的洗涤步骤后，加入25μL 1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以用5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液用水稀释配制而成。沸水浴煮沸10分钟。
- 可以取10～20μL用于Western检测。
- 接步骤2.g，在完成所有的洗涤步骤后，加入25μL 1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以用5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液用水稀释配制而成。沸水浴煮沸10分钟。
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